威尼斯886699Aplo®系列CHO悬浮培养基参数推荐
中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是首个被美国FDA、欧盟EMA和中国CFDA认可的用于生物制药领域的生产细胞，已广泛应用于各种治疗性蛋白质药物的大规模制备，包括重组抗体、重组单体蛋白质以及重组融合蛋白质等。目前，科学家已成功分离出的不同亚型的CHO细胞株，比如CHO-K1, CHO-S, CHO DXB11, CHO DG44, CHO-M以及近年来受到持续关注的GS基因敲除的CHO细胞。CHO-K1是最早的从最初的仓鼠卵巢组织中分离克隆建立的细胞系之一，并且至今仍然不断被生物制药工业和生物药机构所研究。CHO-K1是未经改造的野生型CHO细胞。最原始的CHO-K1细胞是贴壁培养，并需要添加血清，由于血清的批间稳定性问题，及后来病毒安全性问题，无血清悬浮培养成为趋势。威尼斯886699可以提供无血清悬浮培养基，用于CHO细胞的悬浮培养和蛋白表达。
本文阐述了使用威尼斯886699的CHO悬浮培养基，培养CHO细胞的操作流程和蛋白表达案例。
实验材料
细胞株：CHO-K1细胞株，购自于ATCC
实验试剂
威尼斯886699自主研发的CHO化学成分限定悬浮培养基：Aplo CHOL1、Aplo CHOL2、Aplo CHO N1；补料培养基：Aplo CHOF1、CHO NF606d
实验耗材和仪器
50mL摇管、125mL摇瓶、250mL摇瓶、500mL摇瓶、1L摇瓶、细胞培养恒温摇床、生物安全柜、细胞离心机、数显恒温水浴锅等
CHO细胞培养操作规程
（1）操作参数
规格 | 范围或值 |
50mLTPP管 | 培养量：10~30mL |
125mL摇瓶 | 培养量：15~40mLl |
250mL摇瓶 | 培养量：40~80mL |
500mL摇瓶 | 培养量：100~200mL |
1000mL摇瓶 | 培养量：200~300mL |
摇床速度 | TPP管：230rpm 振幅50mm 摇瓶：140~160rpm 振幅25mm 90-125rpm 振幅50mm |
培养基 | Aplo CHOL1、Aplo CHOL2、 Aplo CHO N1 |
补料培养基 | Aplo CHOF1、CHO NF606d |
接种密度 | 0.5x106cells/mL |
培养温度 | 37℃ |
降温温度 | 33℃ |
二氧化碳浓度 | 5% |
相对湿度 | 80% |
（2）培养基的适应
通常情况下，不需要进行培养基的适应，可直接替换成Aplo CHOL1/L2/N1。如果直接替换细胞生长不佳，在原用培养基中生长的CHO细胞需要转移到由原用培养基和新培养（Aplo CHOL1/L2/N1）组成的新培养基中进行适应性生长。
直接适应：最初培养阶段，细胞按初始密度 0.5×106cells/mL 接种，直接将培养基更换为Aplo CHOL1/L2/N1进行培养。待细胞培养2-3代，且生长稳定后进行后续实验。CHO 细胞稳定生长时按 0.5-0.8×106cells/mL 密度接种，培养72h密度≥4×106cells/mL，细胞活率≥98%。
间接适应：保持初始接种密度为 0.5×106cells/mL。细胞培养过程中逐步减少原培养基直至完全在Aplo CHOL1/L2/N1中培养。原培养基与Aplo CHOL1/L2/N1配比阶段比例推荐为（75:25、50:50、25:75 ，最终为100%的Aplo CHOL1/L2/N1），每个阶段至少适应 3 代，细胞生长稳定后进行后续实验。CHO细胞稳定生长时按0.5-0.8×106cells/mL 密度接种，72h密度≥4×106cells/mL，细胞活率≥98%。
注意事项：
根据细胞具体情况选择进行培养基直接适应或者间接适应。
细胞驯化初期，若出现细胞生长密度较低、细胞结团等其他不稳定状态，根据当天细胞密度选择传代方式（稀释传代、离心传代）。
稀释传代：根据细胞密度计算传代时所需细胞悬液，去除多余细胞悬液并补加新鲜培养基至培养体积。
离心传代：根据细胞密度计算传代时所需细胞悬液，进行800rpm离心5min，去除上清，用新鲜培养基重悬细胞。
（3）细胞传代和扩增
①37℃水浴中预热Aplo CHOL1/L2/N1培养基；
②使用75%酒精清洁/消毒生物安全柜；
③使用75%酒精喷洒培养基瓶，并置于生物安全柜；
④从培养箱中取出摇瓶（或TPP管），喷洒75%酒精并置于生物安全柜；
⑤取0.5mL细胞悬液，用细胞计数仪分析活细胞密度（×106cells/mL）和细胞活率（%）；
⑥传代前，如果细胞密度低于2.0×106cells/mL，或细胞活率低于80%，需要150g（大约800rpm）离心5分钟处理细胞。轻轻弃去上清，使用100%新鲜培养基按0.5×106cells/mL重悬细胞，并将细胞接种至新摇瓶（或TPP管），传代后按照规定的环境条件培养细胞（见操作参数）；
⑦如果传代前细胞密度高于2.0×106cells/mL且细胞活率率高于85%，则将适量的细胞悬液转移到新摇瓶（或TPP管）中，并用新鲜培养基直接调整最终培养体积进行细胞传代，然后在规定的环境条件下培养细胞（见操作参数）。这意味着如果传代比（传代后的种子密度：传代前的细胞密度）大于1:4，细胞需要离心并重新悬浮在100%新鲜培养基中。
（4）细胞冻存
①细胞冷冻前，将含新鲜异丙醇的程序降温盒、冻存管等所需材料置于4℃冰箱中，预冷至少1小时；
②取样计数，检测分析活细胞密度（×106cells/mL）和细胞活率（%）；
③使用含7.5%DMSO的细胞冻存液(Aplo CHOL1/L2/N1+7.5%DMSO)冻存；
④根据冻存细胞的数量、冻存体积和冻存密度（建议冻存密度为10~20×106cells/mL/支），计算所需的细胞量，并移入离心管中，以800rpm（即150g）离心5min；
⑤弃去上清液，拍打离心管底部使细胞均匀分散，加入提前配制好且4℃预冷的细胞冻存液，轻轻吹打细胞，形成均匀的细胞悬液；
⑥用一次性无菌移液管将1mL~1.5mL细胞冻悬液移入预冷冻存管中，置于冰上保存；
⑦冻存细胞悬液在分装过程中需要反复混合。分装完成后，将冻存管转移至预冷的程序降温盒中，在-80℃冰箱中保存至少24小时。24后小时转移至液氮罐中继续保存。
CHO-K1细胞连续传代结果
如图1和2所示，在Aplo CHOL1/L2/N1培养基中，以0.5×106cells/mL接种，每72小时传代，连续传代30次，细胞密度维持在4-6×106cells/mL（倍增时间22±2小时）之间，实验细胞长期稳定传代。
图1：CHO-K1细胞在Aplo CHOL1/L2/N1中连续传代生长曲线图
图2：CHO-K1细胞在Aplo CHOL1/L2/N1中连续传代倍增时间曲线图
摇瓶中抗体表达
使用威尼斯886699商业化基础培养基Aplo CHOL1/Aplo CHOL2/Aplo CHON1，在摇瓶中进行流加培养，细胞生长结果和蛋白表达如图3和4所示。
细胞株：CHO-K1单克隆抗体表达稳定株
培养条件：初始温度36.5℃、转速125rpm、5%CO2、湿度80%、D5降温至33℃
接种密度：1×106cells/mL
流加工艺：D2开始隔天补料、补料比例5%P1/0.5%P2。
收获条件：D16或活率低于70%收获
在摇瓶为期16天的流加培养中，单克隆细胞株在三种商业化培养基中的峰密度为25~32×106cells/mL之间，D14蛋白表达量均在7.2g/L以上，延长培养，D16产量在8.4g/L以上，活率在75%以上。
图3：摇瓶中细胞生长曲线
图4：摇瓶中蛋白表达量
反应器中抗体表达
对摇瓶中流加培养工艺进行反应器验证，反应器工艺条件如下所示：
细胞株：CHO-K1单克隆抗体表达稳定株
培养基：威尼斯886699商业化生长培养基：Aplo CHOL1/Aplo CHOL2/Aplo CHON1
补料培养基：威尼斯886699商业化补料培养基：Aplo CHOF1 Feed-P1/Aplo CHOF1 Feed-P2
培养条件：初始温度36.5℃、转速300rpm、溶氧40%、PH:7.00±0.2、底通0.01vvm，D5降温至33℃
接种密度：1×106cells/mL
流加工艺：D2开始隔天补料、补料比例5%P1/0.5%P2
收获条件：D16或活率低于70%收获
对摇瓶结果进行反应器确认，在反应器中进行为期16天的流加培养，细胞生长和表达量基本与摇瓶一致，细胞峰密度也在25~32×106cells/mL之间，D14蛋白表达量均在7.2g/L以上，延长培养，D16产量在8.4g/L以上，活率在75%以上。威尼斯886699三种商业化CHO生长培养基(Aplo CHOL1/Aplo CHOL2/Aplo CHON1)和补料满足行业蛋白表达的需求且可稳定放大生产蛋白。
图5：反应器中细胞生长曲线
图6：反应器中蛋白表达量
(0575) 8070 9355
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